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分子荧光光谱法测定维生素B2的含量
来源:http://www.lab-spectrum.com/   作者:紫外可见分光光度计    更新日期:2016-09-30 11:14:26   
摘要:分子荧光光谱法测定维生素B2的含量。

分子荧光光谱法测定维生素B2的含量

A. 实验原理
常温下,处于基态的分子吸收一定的紫外—可见光的辐射能成为激发态分子,激发态分子通过无辐射跃迁至第一激发态的最低振动能级,再以辐射跃迁的形式回到基态,发出比吸收光波长长的光而产生荧光。固定一个假设的发射波长进行激发波长扫描,找出最大激发波长λex,然后固定最大激发光波长λex进行荧光发射波长扫描,找出最大发射波长λem。最大激发波长和最大发射波长的选择是本实验的关键。
在稀溶液中,荧光强度与物质的浓度呈线性关系。由于荧光物质具有猝灭效应,此方法仅适用于痕量物质分析。
维生素B2也称核黄素,是橘黄色无臭的针状结晶。易溶于水,而不溶于乙醚等有机剂。光照易分解,对热稳定,在中性或酸性溶液中稳定,在碱性溶液中较易被破坏。维生素B2水溶液在430~440 nm蓝光或紫外光照射下会发出绿色荧光,荧光峰在525 nm附近,在pH为6-7的溶液中荧光强度最大。最大激发波长λex=465 nm,最大发射波长λem=520 nm。pH=11时,荧光消失。维生素B2在水溶液中稳定。在稀溶液中,其荧光度与维生素B2溶液浓度呈线性关系。
维生素B2在碱性溶液中经光线照射会发生分解而转化为另一物质光黄素,光黄素也能发出荧光,其荧光强度比维生素B2强,所以测量维牛素B2的荧光时要控制在酸性和避光条件下进行。
B. 仪器、试剂
1.仪器
RF-530IPC荧光分光光度计;电子天平
移液管(2 mL);棕色容量瓶(50 mL、1000 mL)。
2.试剂
维生素B2;冰醋酸(分析纯);多维葡萄糖粉(含有维生素Bi、维生素B2、维生素C、维生素D和葡萄糖)。
3.标准溶液的配制
维生素B2标准储备液(10μg·mL^-1):准确称取10.0 mg维生素B2,用热去离子水溶解后,转入1000 mL棕色容量瓶中,冷却后加去离子水至刻度,摇匀,置于暗处冰箱内保存。
C. 实验步骤(略)
D. 注意事项
(1)吸量管、容量瓶的正确使用及移液、守容须规范操作,配制标准溶液时,为了减少误差,取不同体积的同种溶液应用同一移液管。
(2)使用荧光分光光度计时,须按照既定程序进行。在測定系列浓度标准溶液的荧光强度时,必须按浓度由低到高的顺序放入测定。
(3)因为荧光是从石英池下部通过,所以拿取石英池时,应用手指捏住池体的上部,不能接触下部。清洗样品池后,应先用吸水纸吸干四个面的液滴,再用擦镜纸往同一方向轻轻擦拭。
(4)在测试样品时,府沣煮样品的浓府不能太高,否则由于存在荧光猝灭效应,样品浓度与荧光强度不呈线性关系,造成定量工作出现误差。

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