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荧光光谱的校正
来源:http://www.lab-spectrum.com/   作者:紫外可见分光光度计    更新日期:2014-11-20 20:47:40   
摘要:荧光分析仪使用的好坏除了与荧光分析仪自身的性能密切相关外,仪器的调试工作也起到了决定性作用。因仪器调试工作不到位,测定数据偏差大而无法使用的例子在现实中也时有发生。

荧光光谱的校正

荧光分析仪使用的好坏除了与荧光分析仪自身的性能密切相关外,仪器的调试工作也起到了决定性作用。因仪器调试工作不到位,测定数据偏差大而无法使用的例子在现实中也时有发生。
由于激发光源在不同波长处发射的光子数存在差异,单色器对各种波长光线的射率也不尽相同,且与偏振光有关的检测器(如PMT)对各种波长的检测效率不一样。而荧光光谱是测定各个不同波长下的荧光体的荧光强度,这些光学部件的光谱特性的差异无法通过扣除空白溶液的方法消除,所以需要对荧光光谱进行校正。
(1)激发光谱的校正    以罗丹明B光量子计数器来校正。首先校正零点;然后把罗丹明B-乙醇溶液( 3g/L)盛人石英三角池,用量为充满石英三角池的2/3积。将其置人样品室,加入高通滤光片滤去杂散光,仅让630nm荧光通过。固定发射波长在630nm,扫描激发单色器(激发扫描的范围从198. 6-601. 4nm),将检测到的信号保存到计算机软件上并进行归一化,得到激发光强度与波长的关系,应为一条与波长无关的直线。移去石英三角池与滤光片,放入分析试样进行激光谱扫描,即可得到样品已校正的激发光谱。激发波长200一600nm范围内,都可以用此法校正。
(2)发射光谱的校正  在校正完激发光谱后(激发光强度已与波长无关),把扩散体放人样品室,发射波长设定为198. 6nm,然后进行激发单色器、发射单色器同波长的同步扫描(扫描的范围从198. 6~601. 4nm),将测得的信号保存到计算机软件上并归一化,归一化后的输出信号应为一条与波长无关的直线。移去扩散体,放入试样进行发射光谱扫描,即可得到样品已校正的发射光谱。发射波长200~600nm范围内,都可以用此法校正。
(3)长波长发射光谱的校正  需校正的发射波长处于长波长区600nm甚至更,副标准光源作为灯源,用它来校正发射光谱的范围在发射波长处于soo-OOnm范围内。,将副标准光源和扩散体放在样品仓内,预热5min,然后进行发射扫描(扫描的范围从498. 6~901. 4nm),移去副标准光源与扩散体,放人试样进行发射光谱扫描,即可得到样品已校正的发射光谱。
(4)长波长激发光谱的校正  在校正完长波长发射光谱后,校正零点,将扩散体放在样品仓内,然后进行激发扫描(扫描的范围从498. 6~901. 4nm),移去扩体,放人试样进行激发光谱扫描,即可得到样品已校正的激发光谱。激发波长500~900nm范围内,都可以用此法校正。
现在某些型号的商品荧光仪在出厂时已经将激发光谱与发射光谱的校正图储存在软件中,用户在测试时可以根据测试需要直接调出来进行谱图校正,更加简便快速。

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